撰文 | nagashi 編輯 | 王多魚

排版 | 水成文

COVID-19大流行仍在持續(xù)，一方面是德爾塔 （Delta） 和奧密克戎 （Omicron） 等新冠變異株的相繼出現(xiàn)，另一方面是美國、英國和加拿大等西方國家逐漸放松對新冠疫情的防控，在可預(yù)見的未來，新冠病毒短期內(nèi)將很難被徹底清除。 面對這種情況， 如何快速診斷新冠病毒感染，及時采取相應(yīng)的治療和隔離措施有助于將新冠疫情的影響降到最低。在當(dāng)下，RT-PCR 是新冠檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但整個檢測流程十分繁瑣，且依賴于熟練的操作人員和精密昂貴的 qPCR 儀。 因此，開發(fā)一種無需復(fù)雜儀器、能進(jìn)行實時現(xiàn)場診斷的檢測技術(shù)對遏制新冠疫情至關(guān)重要。 

2022年3月21日，武漢大學(xué) 殷昊 教授和張楹教授團(tuán)隊合作，在 Nature 子刊 Nature Biomedical Engineering 上發(fā)表了題為： Fast and sensitive detection of SARS-CoV-2 RNA using suboptimal protospacer adjacent motifs for Cas12a 的研究論文。 該研究開發(fā)了基于 CRISPR-LbCas12a 的新冠快速檢測工具—— sPAMC ，該方法使用次優(yōu) PAM 基序，在允許 crRNA 設(shè)計靈活性的同時，還增強(qiáng)了 LbCas12a 介導(dǎo)的熒光探針切割。研究結(jié)果顯示， sPAMC技術(shù)兼具快速性、靈敏性和準(zhǔn)確性 ，能在20分鐘內(nèi)完成對新冠病毒 （SARS-CoV-2） 的檢測，靈敏性與 RT-PCR 相當(dāng) ，在 SARS-CoV-2 真實樣本中達(dá)到94.2%準(zhǔn)確度且無一例假陽性。  

基于 CRISPR 的診斷技術(shù)已成為診斷 SARS-CoV-2 十分有潛力的方法。相比于傳統(tǒng)的熒光RT-PCR檢測方法，CRISPR 檢測技術(shù)可以在大約一個小時內(nèi)檢測出病毒，并且可以實現(xiàn)無儀器化的現(xiàn)場診斷，避免繁瑣而漫長的送樣過程。 2017年4月，張鋒團(tuán)隊在 Science 發(fā)表論文，發(fā)明了基于 CRISPR-Cas13 的病毒檢測技術(shù)。張鋒將這種檢測技術(shù)命名為—— SHERLOCK ，這一與神探夏洛克·福爾摩斯同名的檢測技術(shù)，可以讓被切割的RNA形成條帶，形成視覺可見的線索，并直觀展示出來。 同時，諾獎得主 Jennifer Doudna 團(tuán)隊也在 Science 發(fā)表論文，發(fā)明了基于 CRISPR-Cas12a 的病毒檢測技術(shù)，并將其命名為—— DETECTR 。 

新冠疫情暴發(fā)后，張鋒和 Jennifer Doudna 將 SHERLOCK 和 DETECTR 用于新冠病毒的檢測，其中SHERLOCK檢測試劑盒于2020年獲得美國FDA緊急授權(quán)。 對于基于 Cas12a 的  DETECTR 檢測技術(shù)，采集核酸拭子后，靶標(biāo)核酸通過等溫擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行信號放大，隨后 Cas12a 蛋白在 crRNA 的引導(dǎo)下，識別等溫擴(kuò)增樣品中的特異性核酸序列，當(dāng)樣本中存在病毒的靶序列序列時，crRNA 與該靶序列結(jié)合，激活 Cas12a 蛋白的“非特異性”切割活性，并隨機(jī)切割溶液中的核酸探針。當(dāng)用短波光照射樣本時，陽性樣本會發(fā)出熒光，而陰性樣本則無熒光，從而判斷樣本中是否含有病毒核酸。  

DETECTR檢測SARS-CoV-2的模式圖 

遺憾的是，DETECTR 等基于 CRISPR 系統(tǒng)開發(fā)的診斷工具雖然在速度上占據(jù)優(yōu)勢，但在靈敏度上不足以匹及臨床檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”——RT-PCR。因此，如何提高CRISPR診斷技術(shù)的靈敏度是使其走向臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。 在這項最新研究中，殷昊團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)，在一步 CRISPR 檢測中，靶標(biāo) DNA 序列的等溫擴(kuò)增和切割過程是同時發(fā)生的。這意味著，在等溫擴(kuò)增過程中該體系的靶標(biāo) DNA 序列存在損耗，從而降低了最終的檢測靈敏度。 因此，研究團(tuán)隊巧妙地設(shè)計了一種新的 crRNA，以避免這種損耗。CRISPR 系統(tǒng)要求靶標(biāo)序列上存在 PAM 基序，LbCas12a 對應(yīng)的最優(yōu) PAM 基序為TTTV （V: A/C/G） ，但在該研究中，研究團(tuán)隊采用了次優(yōu) PAM 基序 （NTTV; TTNT） ，可以減少 LbCas12a 對靶標(biāo) DNA 分子的切割，同時還能將反應(yīng)速度加快2-3倍。

采用次優(yōu)PAM基序的sPAMC的檢測速度更快 不僅如此，與使用最優(yōu) PAM 基序的一步 CRISPR 檢測相比，sPAMC 具有更高的靈敏度和可靠性： 在 RT-qPCR 檢測 Ct 值為18.1~35.8的204份咽拭子標(biāo)本中，sPAMC 檢測新冠病毒的靈敏度為94.2%，特異性為100%。此外，即使是在未提取病毒核酸的樣本中，sPAMC 可以在10分鐘內(nèi)檢測人類巨細(xì)胞病毒 （HCMV） DNA 病毒，15分鐘內(nèi)檢測新冠 RNA 病毒，兩種情況下的檢測限與qPCR相當(dāng)。 并且僅用便攜式紫外燈或藍(lán)光燈照射即可觀察到結(jié)果。  

次優(yōu)PAM基序介導(dǎo)的一步反應(yīng)具有更高的靈敏度和可靠性 值得注意的是，并不是所有的 DNA 序列都有 TTTV 基序，這也限制了 crRNA 的靈活設(shè)計，而次優(yōu) PAM 序列擁有更高的豐度，從而使得檢測更加靈活，例如更容易針對新冠病毒的保守序列設(shè)計相應(yīng)的 crRNA，從而檢測多種新冠變異株；或者針對突變序列設(shè)計 crRNA，從而鑒定感染的是哪一種新冠變異株。

研究模式圖 

總而言之，sPAMC 是一種基于 CRISPR 技術(shù)開發(fā)的新型病毒檢測方法，集眾多優(yōu)點于一體：快速 （20min內(nèi)完成檢測） 、易于使用 （對未提取樣品進(jìn)行一步檢測） 、靈敏度高 （與RT-qPCR一樣靈敏、可靠、靈活） 。 

論文鏈接 ： https://www.nature.com/articles/s41551-022-00861-x